РЕЗЮМЕ
Проведено исследование по оценке фармакодинамических свойств липосомальных и нелипосомальных форм коэнзима Q10, ресвератрола и глутатиона на модели фокальной церебральной ишемии у крыс. Результаты показали, что липосомальные формы всех трех веществ значимо повышают активность антиоксидантных ферментов (СОД, каталазы, глутатионпероксидазы) и митохондриальных ферментов (аконитазы, цитратсинтазы), снижают уровень маркеров окислительного стресса (ТБК-АП) и эндотелиальной дисфункции (ADMA) по сравнению с нелипосомальными аналогами. Наиболее выраженный терапевтический эффект наблюдался при комбинированном применении липосомальных форм, что свидетельствует о синергизме их действия. Липосомальная доставка повышает биодоступность и эффективность изученных соединений, что делает их перспективными для нейропротективной терапии ишемического инсульта.

Ключевые слова: церебральная ишемия, липосомальные формы, коэнзим Q10, ресвератрол, глутатион, антиоксидантные ферменты, митохондриальные ферменты, окислительный стресс, нейропротекция.

Для цитирования: Кукес И.В. Оценка фармакодинамических свойств глутатиона, коэнзима Q10 и ресвератрола на модели церебральной ишемии in vivo. Лекарственные средства и рациональная фармакотерапия. 2025; 4(17): 30–38.
doi: 10.56356/27827259_2025_17_30

ВВЕДЕНИЕ
Ишемический инсульт является одним из наиболее распространенных типов нарушения мозгового кровообращения, вызванного закупоркой артерии, снабжающей мозг кровью. Лечение ишемического инсульта направлено на восстановление кровотока, минимизацию повреждения мозга и предотвращение дальнейших осложнений. Одним из ключевых аспектов терапии являются нейропротекторные препараты, направленные на защиту нервных клеток от повреждений и стимулирование восстановления нервной ткани.

Нейропротекторы представляют собой группу препаратов, направленных на уменьшение степени поражения нейронов и стимуляцию регенерации тканей головного мозга. Среди множества нейропротекторов выделяются три вещества, обладающие выраженными антиоксидантными свойствами и способностью улучшать энергетический метаболизм клетки: коэнзим Q10, ресвератрол и глутатион.

Коэнзим Q10 играет важную роль в клеточном дыхании и митохондриальном биосинтезе АТФ. Дефицит коэнзима Q10 способствует увеличению окислительного стресса и нарушению метаболизма энергии, что усугубляет повреждение мозга при ишемическом инсульте. Липосомальная форма коэнзима Q10 улучшает биоусвояемость препарата благодаря защите активного компонента липидной оболочки, способствуя лучшему проникновению коэнзима внутрь клетки и повышению эффективности терапии [1].

Доклинические исследования показывают улучшение когнитивных функций и снижение неврологического дефицита у животных моделей ишемического инсульта при применении коэнзима Q10. Клинические испытания подтверждают безопасность и потенциальную эффективность коэнзима Q10 в лечении последствий инсульта [2].
Ресвератрол обладает мощными антиоксидантными и противовоспалительными свойствами, что помогает уменьшить воспаление и предотвратить гибель нейронов. Доклинические данные демонстрируют способность ресвератрола уменьшать размер инфаркта мозга и снижать неврологический дефицит у животных моделей ишемического инсульта. Однако низкая растворимость и быстрая деградация ресвератрола ограничивали его применение. Липосомальные формы ресвератрола позволяют повысить стабильность и всасываемость препарата, увеличивая его терапевтическое действие [3].

Клиническое исследование показало положительное влияние липосомального ресвератрола на восстановление двигательных функций пациентов с последствиями ишемического инсульта, однако необходимы дополнительные масштабные исследования для подтверждения результатов [4].

Глутатион представляет собой мощный эндогенный антиоксидант, защищающий клетки от свободных радикалов и токсичных продуктов перекисного окисления липидов. Его недостаток приводит к усиленному повреждению мембран клеток и гибели нейронов. Применение экзогенного глутатиона способно восполнить этот дефицит и снизить степень повреждения мозга. Липосомальная форма глутатиона обеспечивает лучшую доставку активного компонента в организм и повышает концентрацию внутриклеточного глутатиона, улучшая защитные механизмы организма [5].

Исследование на животных моделях продемонстрировало значительное сокращение размера очага ишемии и ускоренное восстановление неврологических функций при введении липосомального глутатиона. Ранние клинические наблюдения также подтвердили положительную динамику состояния пациентов с использованием липосомального глутатиона, хотя требуются дальнейшие исследования для полной оценки клинической значимости [6].

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Целью работы явилась оценка церебротропной активности липосомальных БАД на основе коэнзима Q10, ресвератрола и глутатиона в сравнении с их нелипосомальными аналогами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Лабораторные животные
Исследование выполнено на 78 половозрелых крысах-самцах Wistar массой 180–200 г, полученных из питомника лабораторных животных «Рапполово» (д. Рапполово, Ленинградская обл.). Крысы содержались в стандартных условиях вивария при температуре воздуха 22±2°С, влажности воздуха 60±5% и суточном цикле 12 часов день / 12 часов ночь. Условия содержания крыс соответствовали требованиям Директивы ЕU 2010/63 и Рекомендациям Коллегии ЕЭК от 14.11.2023 № 33 «О Руководстве по работе с лабораторными (экспериментальными) животными при проведении доклинических (неклинических) исследований».

Модель церебральной ишемии
Фокальную церебральную ишемию моделировали по методу Tamura путем необратимой термокоагуляции средней мозговой артерии: крыс анестезировали хлоралгидратом
(350 мг/кг, внутрибрюшинно), выбривали область ниже и правее глаза, рассекали мягкие ткани и удаляли отросток скуловой кости. Бором с алмазной фрезой проделывали трепанационное отверстие диаметром ~1,5 мм под местом пересечения средней мозговой артерии с обонятельным трактом и термокоагулятором коагулировали артерию. Рану ушивали и обрабатывали 10% раствором повидон-йода [7].

Экспериментальные группы
В ходе исследования было сформировано 13 экспериментальных групп:
• ЛО — ложнооперированные животные, которым церебральную ишемию не моделировали, но применяли все последовательные операционные манипуляции;
• НК — негативный контроль: группа крыс с ишемией, но лишенная терапии;
• липоКоQ10 — группа крыс с ишемией, получавшая липосомальный КоQ10 (Liposomal Vitamins);
• КоQ10 NOW — группа крыс с ишемией, получавшая КоQ10 NOW;
• КоQ10 — группа крыс с ишемией, получавшая КоQ10 (Kolbri Nutrition);
• липоРес — группа крыс с ишемией, получавшая липосомальный ресвератрол (Liposomal Vitamins);
• Рес NOW — группа крыс с ишемией, получавшая ресвератрол NOW;
• Рес — группа крыс с ишемией, получавшая ресвератрол (Healthy Origins);
• липоGSH — группа крыс с ишемией, получавшая липосомальный глутатион (Liposomal Vitamins);
• GSH NOW — группа крыс с ишемией, получавшая глутатион NOW;
• GSH — группа крыс с ишемией, получавшая глутатион (Protein Company);
• липоКомб — группа крыс с ишемией, получавшая комбинацию липосомальных КоQ10, ресвератрола и глутатиона;
• Комб — группа крыс с ишемией, получавшая комбинацию КоQ10, ресвератрола и глутатиона NOW.
КоQ10, ресвератрол и глутатион (вне зависимости от производителя) вводили перорально, через 30 мин после моделирования ишемии и далее однократно в сутки на протяжении 3 дней в дозах: 7,8 мг/кг, 16 мг/кг и 32 мг/кг. Дозы рассчитаны с учетом рекомендаций по применению и коэффициента межвидового пересчета [8].

Подготовка биоматериала для анализа
Время экспозиции составило 72 часа, после чего у животных под анестезией (хлоралгидрат, внутрибрюшинно, 305 мг/кг) осуществляли забор крови из брюшной аорты, затем декапитировали и извлекали головной мозг, отделяли правое полушарие, которое гомогенизировали в буферном растворе, состоящем из 1 ммоль ЭГТА + 215 ммоль маннита + 75 ммоль сахарозы + 0,1% раствора бычьего сывороточного альбумина + 20 ммоль HEPES + 0,25% раствора трипсина с рН 7,2. Полученный гомогенат центрифугировали при 1100 g, 2 минуты. Полученный супернатант в количестве 700 мкл переносили в пробирки типа Эппендорф и наслаивали 75 мкл 10% раствора перколла, после чего центрифугировали при 18 000 g в течение 10 минут. Осадок ресуспендировали в 1 мл изолирующей среды и повторно центрифугировали в течение 5 минут при 10 000 g. Полученный супернатант использовали для оценки активности аконитазы, цитратсинтазы, каталазы, супероксиддисмутазы (СОД), глутатионпероксидазы (ГП), концентрации активных продуктов, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-АП).
Цельную кровь центрифугировали при 3500 RPM, 10 минут. В полученной сыворотке крови определяли содержание асимметричного диметиларгинина (ADMA).

Оценка активности ферментов
Методы определения активности аконитазы
Активность аконитазы определяли спектрофометрически при 340 нм путем детекции НАДФН, который образуется в сопряженных реакциях, катализируемых аконитазой и изоцитратдегидрогеназой. Среда инкубации содержала: изоцитрат дегидрогеназа 0,03 Ед/л; НАДФ+ 0,32 мг/мл; PBS — 55 μл, исследуемый биоматериал — 50 μл (положительный контроль — аконитаза 0,03 Ед/л). Реакцию начинали добавлением цитрата натрия 0,1 мг/мл. Регистрировали изменение оптической плотности полученных растворов при 340 нм при 370 С в течение 2 минут. Активность аконитазы рассчитывали по изменению оптической плотности, используя коэффициент экстинкции 0,0313 μМ-1. Активность фермента была выражена в ЕД / мг белка / мин [9].
Методы определения активности цитратсинтазы
Активность цитратсинтазы оценивали по методу, предложенному Shepherd & Garland, основанному на спектрофотометрическом определении окрашенных продуктов распада 5,5'-ди-тиобис- (2-нитробензойной кислоты) в присутствии ацетил-КоА и оксалоацетата. Реакционная смесь содержала: 5,5'-ди-тиобис-(2-нитробензойная кислота) 100 мм; Трис-HCl буфер с рН от 7,8 до 100 мм; ацетил-СоА 100 мм; 0,1% Тритон-х 100 μл и 4 μл исследуемого супернатанта. Реакцию начинали с добавления 100 μл оксалоацетата. Изменение поглощения регистрировали при длине волны 412 Нм в течение 3 минут при комнатной температуре. Активность цитратсинтазы была выражена в ЕД / мг белка / мин [10].

Методы определения активности супероксиддисмутазы
Активность супероксиддисмутазы (СОД) оценивали ксантин-ксантиноксидазным методом, основанным на реакции дисмутации супероксидного радикала, образующегося в ходе окисления ксантина и восстановления 2-(4-йодофенил)-3-(4-нитрофенол)-5-фенилтетразолия хлорида. Среда инкубации содержала: ксантин 0,05 ммоль/л; 2-(4-йодофенил)-3-(4-нитрофенол)-5-фенилтетразолия хлорид 0,025 ммоль/л; ЭДТА 0,94 ммоль/л, ксантиноксидаза 80 Ед/л, CAPS — 40 ммоль/л. Оптическую плотность смеси регистрировали при 505 нм [11].

Методы определения активности глутатионпероксидазы
Активность глутатионпероксидазы (ГП) определяли в супернатанте гомогената головного мозга в сопряженной глутатионредуктазной реакции по убыли НАДФН. Среда инкубации содержала: 1 ммоль/л ЭДТА, 50 мМ К,Na-фосфатного буфера, рН 7,4; 1 ед. акт./мл глутатиоредуктазы; 20 ммоль/л НАДФН; 1 ммоль/л GSH; 30–60 мкг белка на 1 мл среды. Оптическую плотность смеси регистрировали на КФК-3 при 340 нм. Реакцию начинали добавлением субстрата (гидропероксид кумола — 1,5 ммоль/л) и проводили при температуре 25°С [12].

Методы определения активности каталазы
Активность каталазы определяли спектрофотометрически по методу Эби путем измерения уменьшения поглощения раствора H2O2 при 240 нм [13].

Методы определения концентрации ТБК-АП
Концентрацию ТБК-АП оценивали спектрофотометрическим методом в реакции конденсации с 2-тиобарбитуровой кислотой, в ходе которой образующийся окрашенный комплекс имеет максимум поглощения при 532 нм. При этом окраска раствора пропорциональна концентрации малонового диальдегида. Количество ТБК-АП рассчитывали по величине молярного коэффициента экстинкции малонового диальдегида [14].

Определение содержания ADMA
Концентрацию ADMA оценивали методом твердофазного иммуноферментного анализа.
В работе использовали видоспецифичные наборы реактивов производства CloudClone corp (США).
Ход анализа:
1. В лунки микропланшета помещали 100 мкл анализируемой сыворотки или стандартного раствора, инкубировали 1 час при 370С.
2. Удаляли жидкость из лунок, добавляли 100 мкл рабочего детектирующего раствора А, инкубировали 1 час при 370С.
3. Удаляли жидкость из лунок, промывали 350 мкл промывающего раствора. Высушивали, добавляли по 100 мкл рабочего раствора детектирующего реагента В. Инкубировали 30 минут при 370С.
4. Удаляли жидкость из лунок, промывали 350 мкл промывающего раствора. Высушивали, добавляли по 90 мкл субстрата ТМБ детектирующего реагента В. Инкубировали 20 минут при 370С.
5. Добавляли 50 мкл стоп-реагента. Перешивали до появления однородной желтой окраски.
Аналитический сигнал регистрировали на микропланшетном ридере Infinite F50 производства Tecan (Австрия).
Статистический анализ
Статистическую обработку полученных результатов осуществляли согласно рекомендациям SAMPL с применением программного пакета StatPlus7.0. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Межгрупповые отличия оценивали в тесте Ньюмена — Кейлса при критическом уровне значимости p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В ходе исследования было показано, что у крыс НК группы активность антиоксидантных ферментов (табл. 1) была ниже, чем у ЛО животных.

При этом активность СОД уменьшилась на 60,8% (p<0,05), каталазы — на 51,6% (p<0,05), ГП — на 52,7% (p<0,05). Среди анализируемых БАД наиболее высокий антиоксидантный потенциал был отмечен у липосомальных форм. Так, при применении липоКоQ10 активность СОД, каталазы и ГП была выше в сравнении с показателем группы НК животных на 83,3% (p<0,05) 65,6% (p<0,05) и 70,6% (p<0,05) соответственно.

На фоне введения крысам липоРес отмечено увеличение (относительно НК группы животных) активности СОД на 136,4% (p<0,05), каталазы — на 114,8% (p<0,05) и ГП — 81,4% (p<0,05). В то же время применение липосомального глутатиона приводило к повышению активности указанных ферментов на 130,2% (p<0,05), 113,1% (p<0,05) и 64,0% (p<0,05) соответственно. Следует отметить, что активность СОД, каталазы и ГП в группах крыс, которые получали липосомальные формы КоQ10, ресвератрола и глутатиона, была выше (p<0,05), чем у животных, получавших их нелипосомальные аналоги.

Применение комбинации липосомальных БАД способствовало увеличению активности СОД на 154,5% (p<0,05), каталазы — 101,6% (p<0,05) и ГП — на 112,1% (p<0,05), тогда как введение нелипосомальной комбинации приводило к повышению активности указанных ферментов на 87,3% (p<0,05), 62,3% (p<0,05) и 79,2% (p<0,05) соответственно.

Активность митохондриальных ферментов (табл. 2) аконитазы и цитратсинтазы у НК группы крыс была ниже, чем у ЛО животных, на 61,4% (p<0,05) и 73,1% (p<0,05) соответственно. Применение липосомальных форм КоQ10, ресвератрола и глутатиона способствовало повышению активности аконитазы в сравнении с показателем НК группы крыс на 82,4% (p<0,05), 64,7% (p<0,05) и 129,4% (p<0,05) соответственно, тогда как активность цитратсинтазы возросла на 161,9% (p<0,05), 223,8% (p<0,05) и 238,1% (p<0,05) соответственно. Необходимо отметить, что активность цитратсинтазы и аконитазы у крыс, получавших липосомальные формы, была достоверно выше (p<0,05), в сравнении с животными, которым вводили нелипосомальные БАД.

На фоне введения липосомальной комбинации КоQ10, ресвератрола и глутатиона активность цитратсинтазы была выше относительно НК группы крыс на 247,6% (p<0,05), тогда как активность аконитазы увеличилась на 152,9% (p<0,05). Применение нелипосомальной комбинации приводило к повышению активности цитратсинтазы и аконитазы на 147,6% (p<0,05) и 111,8% (p<0,05) соответственно.

Концентрация ТБК-АП (рис. 1) у крыс НК группы достоверно увеличилась в сравнении с ЛО животными в 4,5 раза (p<0,05). При применении липосомальных КоQ10, ресвератрола и глутатиона, а также их липосомальной и нелипосомальной комбинации содержание ТБК-АП снизилось относительно НК группы крыс на 44,1% (p<0,05), 38,4% (p<0,05), 38,5% (p<0,05), 72,0% (p<0,05) и 45,3% (p<0,05) соответственно.

Содержание ADMA (рис. 2) у крыс НК группы было выше аналогичного у ЛО животных в 7,4 раза (p<0,05). Введение животным липосомальных КоQ10, ресвератрола и глутатиона и их комбинации приводило к снижению концентрации ADMA относительно НК группы крыс на 37,8% (p<0,05), 46,9% (p<0,05), 39,4% (p<0,05) и 78,0% (p<0,05) соответственно. Применение нелипосомальных форм не оказало значимого влияния на концентрацию ADMA у крыс с фокальной церебральной ишемией.

Концентрация ТБК-АП (рис. 1) у крыс НК группы достоверно увеличилась в сравнении с ЛО животными в 4,5 раза (p<0,05). При применении липосомальных КоQ10, ресвератрола и глутатиона, а также их липосомальной и нелипосомальной комбинации содержание ТБК-АП снизилось относительно НК группы крыс на 44,1% (p<0,05), 38,4% (p<0,05), 38,5% (p<0,05), 72,0% (p<0,05) и 45,3% (p<0,05) соответственно.

Содержание ADMA (рис. 2) у крыс НК группы было выше аналогичного у ЛО животных в 7,4 раза (p<0,05). Введение животным липосомальных КоQ10, ресвератрола и глутатиона и их комбинации приводило к снижению концентрации ADMA относительно НК группы крыс на 37,8% (p<0,05), 46,9% (p<0,05), 39,4% (p<0,05) и 78,0% (p<0,05) соответственно. Применение нелипосомальных форм не оказало значимого влияния на концентрацию ADMA у крыс с фокальной церебральной ишемией.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенное исследование показало, что в условиях экспериментальной фокальной ишемии для коррекции функционального состояния мозговой ткани целесообразно применение липосомальных форм КоQ10, ресвератрола и глутатиона. Данный терапевтический подход позволяет достичь более высоких (в сравнении с нелипосомальными формами) показателей антиоксидантного и метаболического статуса. В то же время сочетанное применение липосомальных БАД сопровождается значительным увеличением терапевтического эффекта, практически нивелируя течение патологического процесса.

На основании проведенного исследования можно сделать следующие ключевые выводы:
1. Липосомальные формы коэнзима Q10, ресвератрола и глутатиона проявляют выраженную церебротропную активность в условиях экспериментальной фокальной ишемии. Они значимо повышают активность ключевых антиоксидантных ферментов (СОД, каталазы, ГП) и митохондриальных ферментов (аконитазы, цитратсинтазы), что свидетельствует о восстановлении антиоксидантной защиты и улучшении энергетического метаболизма в мозговой
ткани.
2. Липосомальные формы превосходят нелипосомальные аналоги по всем изученным показателям. Это подтверждает, что липосомальная доставка повышает биодоступность, стабильность и тканевую пенетрацию активных веществ, что усиливает их фармакодинамический эффект.
3. Наиболее эффективной стратегией является комбинированное применение липосомальных форм коэнзима Q10, ресвератрола и глутатиона. Комбинация демонстрирует синергический эффект, практически полностью нивелируя патологические изменения, вызванные ишемией, и приближая показатели к уровню ложнооперированных животных.
4. Липосомальные формы значимо снижают уровень маркеров окислительного стресса (ТБК-АП) и эндотелиальной дисфункции (ADMA), что указывает на их способность уменьшать повреждение клеток и улучшать сосудистую функцию в условиях ишемии.

Практические рекомендации:
• Для доклинических и клинических исследований целесообразно использовать липосомальные формы коэнзима Q10, ресвератрола и глутатиона как наиболее эффективные и биодоступные.
• При разработке нейропротективных схем лечения ишемического инсульта следует рассматривать комбинированную терапию липосомальными формами данных веществ для достижения максимального терапевтического эффекта.
• Рекомендуется провести дальнейшие исследования для оптимизации дозировок, длительности применения и изучения отдаленных последствий терапии липосомальными антиоксидантами.
• В клинической практике следует учитывать потенциал липосомальных форм как средств адъювантной терапии, направленной на снижение окислительного стресса и улучшение метаболического состояния пациентов после ишемического инсульта.
Таким образом, липосомальные формы коэнзима Q10, ресвератрола и глутатиона представляют собой перспективное направление в разработке нейропротективных препаратов для коррекции последствий церебральной
ишемии.