РЕЗЮМЕ
Проведено сравнительное исследование пробиотиков Аципол Форте, Бак-Сет Форте, Линекс Форте и Энтерол in vitro. Целю исследования было сравнить пробиотики: по скорости и плотности образования многовидовых биопленок; степени деградации в процессе культивирования; способности проявлять антагонистическую активность по отношению к планктонным клеткам E. coli и C. difficile; оценить свойство образовывать биопленки пробиотиками; изучить влияние пробиотиков как на формирующиеся и сформированные биопленки патогенных микроорганизмов.

Бактерии, усиленные цинком, входящие в состав Аципол Форте, за то же время культивирования, что и другие препараты, показало самую быструю скорость роста с образованием более плотных биопленок, которые также были менее подвержены деградации, относительно биопленок других пробиотиков. В результате исследования было выявлено, что пробиотики бактериальной природы проявляли антагонистическую активность как по отношению к планктонным клеткам E. coli и C. difficile, так и против формирующихся и сформированных биопленок E. сoli.

Пробиотик Аципол Форте показал максимально выраженную активность по сравнению с другими пробиотики к планктонным клеткам E. coli и C. difficile, а также к формирующимся и зрелым биопленкам E. coli. Полученные данные дают возможность рассматривать использование современного пробиотика Аципол Форте, штаммовый состав которого усилен цинком, в качестве перспективного инструмента для быстрого решения различных клинических задач, связанных с дисбиозом.

Ключевые слова: пробиотики, биопленки, антагонистическая активность, антибиотик-ассоциированная диарея, дисбактериоз.

Для цитирования: Детушева Е.В., Сон Э., Детушев К.В., Фурсова Н.К., Кукес И.В. Оценка жизнеспособности и антагонистической активности пробиотиков. Исследование in vitro. Лекарственные средства и рациональная фармакотерапия. 2025; 4(17): 39-50.
doi: 10.56356/27827259_2025_17_39

ВВЕДЕНИЕ
На сегодняшний день многочисленные исследования показывают, что пробиотики участвуют в поддержании баланса и стабильности микробиоты кишечника, регулируют состав кишечной флоры, поддерживают эпителиальный барьер, препятствуют прикреплению патогенов к поверхности кишечника, а также модулируют и способствуют правильному развитию иммунной системы. В иммунной системе пробиотики усиливают как врожденный, так и адаптивный иммунный ответ посредством взаимодействия бактерий, эпителия и иммунных клеток, действуя как Toll-подобные рецепторы (TLR) и модулируя дендритные клетки (DC). Поэтому в современной клинической практике пробиотики рассматриваются как перспективный инструмент для профилактики и комплексного лечения заболеваний, ассоциированных с дисбиозом [1, 2]. Эффективность пробиотиков при острых инфекционных диареях подтверждена в многочисленных клинических исследованиях и метаанализах, где их применение позволило сократить длительность диареи, а их роль в профилактике антибиотик-ассоциированной диареи (ААД), доказана снижением ее развития на 36% при использовании лактобактерий [3].

Помимо этого, пробиотики продемонстрировали способность снижать риск развития острых респираторных инфекций и показали конкурентно ингибирующее действие на патогенные бактерии, включая C. difficile, посредством синтеза бактериостатических молекул [3, 4].

Пробиотические микроорганизмы реализуют свои защитные эффекты через комплекс взаимосвязанных механизмов. Первый механизм основан на конкуренции за питательные вещества и места адгезии на эпителии кишечника, при этом адгезия пробиотических микроорганизмов к слизистой оболочке кишечника является желательным свойством, обеспечивающим их колонизационную резистентность и препятствующим заселению патогенными микроорганизмами [4]. Второй механизм предусматривает продукцию антимикробных веществ — молочнокислые и уксусные бактерии синтезируют органические кислоты (молочная, уксусная, пропионовая), регулирующие pH среды кишечника, а также высокоорганизованные антимикробные пептиды — бактериоцины (низин, лактоцидин, ацидофилин), действующие более выраженно, чем антибиотики [5].

Третий механизм связан с иммуномодуляцией — пробиотики взаимодействуют с Toll-подобными рецепторами (TLR-2, TLR-4, TLR-9) на эпителиальных и иммунных клетках, активируя NF-κB и стимулируя продукцию противовоспалительных цитокинов (IL-10). Различные штаммы пробиотических микроорганизмов обладают дифференцированным эффектом: Bifidobacterium spp. индуцируют IL-10 и подавляют TNF-α, IL-6, тогда как Lactobacillus стимулируют интерфероны и Th1 ответ [6]. Пробиотики типа Lactobacillus rhamnosus GG и Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 повышают продукцию секреторного IgA и лизоцима, обеспечивая локальную защиту, а также активируют регуляторные Т-клетки, усиливая противоинфекционный иммунитет при одновременном предотвращении аллергических реакций [7]. Четвертый механизм предполагает защиту и укрепление эпителиального барьера путем усиления экспрессии белков плотных контактов, повышения секреции муцина и секреторного IgA, что предотвращает транслокацию патогенов через кишечный эпителий. Эти механизмы действуют комплексно, обеспечивая селективную проницаемость кишечного барьера и защиту от инфекционных агентов [8, 9].

Антагонистическая активность пробиотических микроорганизмов реализуется различными механизмами и в зависимости от типа средства может значительно варьировать. Моноштаммовые пробиотики проявляют исходные антагонистические свойства, однако поликомпонентные средства демонстрируют потенциально более высокую эффективность, если оказывают синергическое взаимодействие между компонентами, — метаболиты одного штамма стимулируют антагонистическую активность другого, а также создают благоприятную окружающую среду для коллективной защиты [10]. Мишени антагонизма включают широкий спектр патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, особое внимание уделяется актуальным патогенам кишечных инфекций: Escherichia coli, входящей в состав как нормофлоры, так и условно-патогенной микробиоты, и Clostridium difficile, возбудителю ААД [11, 14].

В настоящее время известно, что большинство бактерий (патогенных, условно-патогенных) существуют не в виде свободно плавающих клеток, а в виде специфически организованных структур — биопленок [15]. Биопленки представляют собой высокоорганизованные бактериальные сообщества, защищенные полисахаридным матриксом, составляющим 85% объема биопленки, что обеспечивает их повышенную устойчивость к антибактерианым препаратам по сравнению с планктонными клетками. Резистентность биопленок достигается за счет замедленного роста клеток вследствие неравномерного распределения кислорода и питательных веществ внутри матрикса, а также присутствия субпопуляции персистеров с нулевой или крайне низкой скоростью роста, что делает их толерантными к антимикробным препаратам.

Микроорганизмы, которые относят к пробиотикам, проявляют деструктивное действие на уже сформированные биопленки благодаря синтезу экзоферментов и протеаз, способных разрушать компоненты полисахаридного матрикса и элиминировать персистеры, что открывает перспективы для разработки комбинированных терапевтических стратегий, объединяющих пробиотики с традиционными антимикробными агентами [16].

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Целью исследования явилась сравнительная оценка пробиотиков по скорости и плотности образования многовидовых биопленок, а также их деградации в процессе культивирования; сравнение способности проявлять антагонистическую активность по отношению к планктонным клеткам патогенных микроорганизмов и разрушению зрелых (сформированных) биопленок патогенов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве модельных штаммов потенциальных возбудителей кишечных инфекций были использованы референс-штаммы микроорганизмов: Escherichia coli ATCC 25922 и Clostridioides difficile ATCC 43255, полученных из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов «ГКПМ-Оболенск».
Коммерческие средства, в состав которых входят штаммы микроорганизмов, обладающие пробиотическими свойствами:
• Аципол Форте: Lactobacillus rhamnosus GG + Bifidobacterium longum CECT 7894 + цитрат цинка;
• Линекс Форте: Lactobacillus acidophilus (LA-5) + Bifidobacterium animalis subsp. lactis (BB-12);
• Бак-Сет Форте: 14 видов штаммов ( Lactobacillus, 4 — Bifidobacterium, Lactococcus, Streptococcus);
• Энтерол — дрожжевой грибок — Saccharomyces boulardii.
В исследовании были использованы питательные среды производства ФБУН ГНЦ ПМБ (Оболенск, Россия):
1. Бифидум среда (состав: панкреатический гидролизат, дрожжевой экстракт, глюкоза, цистеин, аскорбиновая кислота, натрия хлорид, магния сульфат, агар микробиологический).
2. ГБМ-агар (панкреатический гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, мясной пептон, глюкоза, натрия хлорид, растворимый крахмал, натрий двузамещенный фосфорнокислый, агар микробиологический).
3. MRS-агар (глюкоза, дрожжевой экстракт, натрия ацетат, магния сульфат, марганца сульфат, Твин 80, калия дигидрофосфат, агар микробиологический).
4. Лактобак Агар (глюкоза, пептический перевар, дрожжевой экстракт, натрия ацетат, аммония цитрат, магния сульфат, марганца сульфат, полисорбат-80 (Твин 80), агар микробиологический).
5. Шоколадный Агар (пептон, гидролизат казеина, крахмал, натрия хлорид, калия фосфат, агар микробиологический, лизированные эритроциты (кровь)).
6. ГРМ-агар (ферментативный пептон, панкреатический гидролизат рыбной муки, натрия хлорид, агар микробиологический).
7. BV-агар (панкреатический гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, мальтодекстрин, L-лизина гидрохлорид, натрия пируват, магний сернокислый, бромкрезоловый пурпуровый, агар микробиологический). Ростовая добавка (L-цистеина гидрохлорид, L-глутамин, никотинамидадениндинуклеотид).

Питательная среда производства Himedia (Индия):
Clostridium Difficile Agar Base (протеозопептон, натрия гидрофосфат, калия дигидрофосфат, магния сульфат, натрия хлорид, фруктоза, агар микробиологический) с добавлением 7% дефибринированной крови барана.

Культивирование микроорганизмов проводили в течение 24–72 часов при температуре 37ºС в аэробных условиях, а также в анаэробных условиях с использованием газогенерирующих пакетов (GasPak EZ Anaerobe Container System Sachets, Becton Dickinson).

Выбор условий культивирования — подбор состава питательных сред, обеспечивающих оптимальный рост всех микроорганизмов, входящих в состав пробиотиков, а также модельных штаммов патогенов.
Содержимое капсулы пробиотиков растворяли в 10 мл стерильного физиологического раствора, после чего готовили 10-кратные разведения и высевали по 0,1 мл из каждого разведения на исследуемые плотные питательные среды. Так же по 0,1 мл из исходного раствора засевали в пробирки с жидкими питательными средами. Инкубировали в анаэробных условиях при 37°С в течение 72 часов, контролируя рост визуально каждые 24 часа. Оптимальной средой культивирования считали ту, которая обеспечивала рост всех видов микроорганизмов, заявленных в инструкции к препарату или листке-вкладыше, а также модельных штаммов патогенов.

Выбор условий культивирования — подбор питательных сред, обеспечивающих совместное культивирование пробиотических штаммов и патогенов (E. coli и C. difficile).

По результатам высева на питательные среды различного состава, подсчета КОЕ и визуального анализа морфологии колоний была выбрана Бифидум среда в жидком и плотном вариантах, для C. difficile была выбрана среда Clostridium Difficile Agar Base с добавлением 7% дефибринированной крови барана. Полученные результаты показали, что штаммы-антагонисты E. coli и C. difficile способны успешно развиваться в анаэробных условиях, необходимых для культивирования пробиотических штаммов. Данный факт подтверждает обоснованность выбора этих штаммов в экспериментах по совместному культивированию для изучения антагонистических свойств пробиотиков и механизмов их взаимодействия с потенциальными патогенными микроорганизмами.

Идентификация бактерий методом времяпролетной масс-спектрометрии
Для подтверждения видовой принадлежности штаммов, входящих в состав пробиотиков, проводили идентификацию на времяпролетном масс-спектрометре серии Microflex (Bruker, Германия) с применением программного комплекса MALDI Biotyper. Для этого одну или несколько колоний культуры штамма ресуспендировали в 0,3 мл деионизованной воды, добавляли 0,9 мл 96% этилового спирта, центрифугировали 2 минуты при 13000 g, удаляли супернатант, подсушивали осадок в стерильном воздушном потоке, добавляли по 0,02 мл муравьиной кислоты (Sigma-Aldrich, США) и ацетонитрила (Sigma-Aldrich, США), ресуспендировали на шейкере Vortex Genius 3 (IKA, Китай) и центрифугировали 2 минуты при 13000 g. Нанесение образцов и тестирование осуществляли согласно инструкции производителя прибора MALDI-TOF Microflex.

Определение числа колониеобразующих единиц консорциума бактерий пробиотических штаммов в исследуемых препаратах
Количество клеток исследуемых штаммов в 1 капсуле/саше пробиотиков определяли, растворяя содержимое 1 капсулы/саше в 10 мл стерильного физиологического раствора, далее готовили 10-кратные разведения и высевали по 0,1 мл из каждого разведения на плотные питательные среды. Культивировали при соблюдении анаэробных условий. По окончании культивирования подсчитывали количество колоний микроорганизмов из каждого разведения и рассчитывали количество КОЕ микроорганизмов в 1 капсуле/саше препарата.

Подготовка пробиотических культур для исследования
Содержимое капсулы засевали в пробирки, содержащие 10 мл жидкой питательной среды. Культивировали при соблюдении анаэробных условий и температуре 37°С в течение 24–48 часов. По завершении культивирования содержимое пробирок тщательно ресуспендировали, затем отбирали аликвоты по 200 мкл и высевали на плотную питательную среду, равномерно растирая шпателем. Культивировали при соблюдении анаэробных условий и температуре 37°С в течение 24–48 часов.

Оценка плотности биопленки, сформированной сообществом штаммов микроорганизмов, входящих в состав пробиотиков.
Культивирование биопленки сообщества пробиотических штаммов микроорганизмов, входящих в состав пробиотиков. В лунки культурального планшета вносили по 0,1 мл жидкой питательной среды. Содержимое пробирок с предварительно подготовленными пробиотическими культурами тщательно ресуспендировали, затем аликвоты по 0,1 мл переносили в лунки культурального планшета. Инкубировали в анаэробных условиях при температуре 37°С в течение 3 суток, через каждые 24 часа, на 6-е сутки проводили оценку плотности формирующейся биопленки, а на 6-е сутки оценивали стабильность сохранения длительно культивируемой биопленки сообщества пробиотических микроорганизмов.

Оценка плотности биопленки, сформированной сообществом штаммов микроорганизмов, входящих в состав пробиотиков. Из лунок планшета осторожно отбирали питательную среду с неприкрепившимися планктонными клетками. Для удаления оставшихся планктонных клеток лунки с биопленками промывали двукратно стерильным физиологическим раствором в объеме культивирования, после чего жидкость полностью удаляли пипетированием. Далее в каждую лунку вносили по 200 мкл 0,1% раствора кристаллического фиолетового, инкубировали биопленки с красителем в течение 10–15 минут при комнатной температуре, после чего краситель полностью удаляли из лунки. Несвязавшийся краситель тщательно смывали физиологическим раствором, затем планшеты высушивали в ламинарном потоке. После полного высыхания поверхности в лунки добавляли 200 мкл 96% этанола, смывая краситель с поверхности лунок. Затем полостью отбирали и помещали в чистые плоскодонные планшеты. Оптическую плотность полученного раствора измеряли при длине волны 590 нм на приборе xMark™ Microplate Absorbance Spectrophotometer (Bio-Rad, США). Результаты измерений интерпретировали, сравнивая показатели OD590 образцов с показателями негативного контроля (чистого растворителя без добавления красителя).

Отсутствие биопленки фиксировали при значениях OD590 образца < OD590 контроля, слабую степень продукции биопленки — при OD590 контроля < OD 590 образца < 2 OD590 контроля, среднюю степень продукции биопленки — при 2 OD590 контроля < 2 OD590 образца < 4 OD590 контроля, высокую степень продукции биопленки — при 4 OD590 контроля < OD 590 образца, в соответствии с рекомендациями Stepanovic et al. (2010) [17].

Изучение антагонистических свойств исследуемых пробиотиков против модельных штаммов патогенных бактерий
Подготовка модельных штаммов патогенов. Для культивирования патогенных бактерий штаммов E. coli ATCC 25922 и C. difficile ATCC 43255 использовали плотные питательные среды, выбранные на первом этапе. Для этого в стерильном физиологическом растворе готовили суспензию суточной бактериальной культуры в концентрации 109 КОЕ/мл и засевали по 100 мкл на поверхность плотной питательной среды, равномерно растирая шпателем по всей поверхности чашки, и оставляли до полного впитывания на 15 минут.

Изучение антагонистических свойств пробиотических штаммов.
В чашках Петри с предварительно подготовленным и выращенным газоном бактерий пробиотических штаммов при помощи стерильного скальпеля вырезали блоки агара размером 10х10 мм. Подготовленные блоки стерильным скальпелем переносили на поверхность чашек Петри с посевами патогенных бактерий E. coli и C. difficile, по одному блоку для бактериального сообщества из каждого пробиотического средства. Инкубировали при соблюдении анаэробных условий и температуре 37°С в течение 72 часов, с детекцией и измерением зон подавления роста патогенов через каждые 24 часа.

Оценка активности биопленки, сформированной сообществом штаммов микроорганизмов, входящих в состав пробиотиков, против модельного штамма E. coli.
Культивирование биопленки сообщества пробиотических штаммов микроорганизмов. В лунки культурального планшета вносили по 0,1 мл жидкой питательной среды. Содержимое пробирок с предварительно подготовленными пробиотическими культурами тщательно ресуспендировали, затем аликвоты по 0,1 мл переносили в лунки культурального планшета. Инкубировали в анаэробных условиях при температуре 37°С в течение 3 суток. По завершении культивирования из лунок планшета осторожно отбирали питательную среду с неприкрепившимися планктонными клетками и промывали биопленки двукратно стерильным физиологическим раствором в объеме культивирования, после чего жидкость полностью удаляли пипетированием.

Оценка антагонистической активности. В лунку культурального планшета со сформировавшейся биопленкой сообщества штаммов микроорганизмов, входящих в состав пробиотиков, вносили 0,2 мл суспензии модельного штамма E. coli в концентрации 103 КОЕ/мл, приготовленной в жидкой питательной среде. Инкубировали в анаэробных условиях при температуре 37°С в течение 24 часов. После инкубации из каждой лунки проводили высев по 10 мкл на плотную питательную среду и инкубировали в аэробных условиях при температуре 37°С в течение 18–24 часов. По истечении времени инкубации проводили визуальный контроль наличия роста E. coli. В случае наличия визуального роста проводили видовую идентификацию выросших колоний для определения их видовой принадлежности методом MALDI-TOF масс-спектрометрии.

Оценка влияния микроорганизмов, входящих в состав пробиотиков, на формирующиеся биопленки
модельного штамма E. coli.
Содержимое пробирок с предварительно подготовленными пробиотическими культурами тщательно ресуспендировали, и аликвоты по 0,1 мл переносили в лунки культурального планшета. Затем во все лунки, содержащие суспензию пробиотика, вносили по 0,1 мл суспензии модельного штамма E. coli в концентрации 103 КОЕ/мл и инкубировали в анаэробных условиях при температуре 37°С в течение 24 часов. В отдельную лунку вносили по 0,2 мл суспензии E. coli и использовали ее в дальнейшем в качестве контроля. По завершении инкубации из каждой лунки проводили высев по 10 мкл на плотную питательную среду и инкубировали в аэробных условиях при температуре 37°С в течение 18–24 часов. По истечении времени культивирования проводили визуальный контроль наличия роста E. coli. В случае наличия визуального роста проводили видовую идентификацию выросших колоний для определения их видовой принадлежности методом MALDI-TOF масс-спектрометрии. Далее проводили оценку плотности образованной биопленки методом окрашивания кристаллическим фиолетовым и сравнивали ее плотность с плотностью биопленки в контрольной лунке, не подвергавшейся воздействию пробиотиков.

Оценка влияния пробиотиков на сформированные биопленки патогенных микроорганизмов.
Подготовка биопленки модельного патогена E. coli. Для получения биопленок использовали 96-луночные плоскодонные культуральные планшеты, в которые засевали по 200 мкл суточной бактериальной культуры штамма E. coli ATCC 25922 в концентрации 106 КОЕ/мл и культивировали 24 часа при температуре 37°С. Затем из лунок планшета осторожно отбирали среду с планктонными клетками. Для удаления оставшихся планктонных клеток лунки с биопленками промывали двукратно стерильным физиологическим раствором в объеме культивирования, после чего жидкость полностью удаляли пипетированием.

Оценка влияния пробиотиков на предварительно сформированную биопленку штамма E. coli.
В лунку культурального планшета со сформировавшейся и отмытой биопленкой E. coli добавляли по 0,2 мл предварительно подготовленной суспензии пробиотиков. В отдельную лунку с биопленкой E. coli добавляли 0,2 мл свежей жидкой питательной среды и использовали ее в дальнейшем в качестве контроля. Планшеты инкубировали в анаэробных условиях при температуре 37°С в течение 24 часов. По истечении времени культивирования проводили визуальный контроль наличия роста E. coli. В случае наличия визуального роста проводили видовую идентификацию выросших колоний для определения их видовой принадлежности методом MALDI-TOF масс-спектрометрии. Далее проводили оценку плотности образованной биопленки методом окрашивания кристаллическим фиолетовым и сравнивали ее плотность с плотностью биопленки в контрольной лунке, не подвергавшейся воздействию пробиотиков.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В ходе проведенного исследования были подобраны питательные среды с оптимальным составом, обеспечивающим наилучший рост микроорганизмов, входящих в состав исследуемых пробиотиков и среды для совместного культивирования пробиотиков и патогенов E. coli и C. difficile.

Оценка видового состава и концентрации исследуемых пробиотиков. Оценка видового состава пробиотиков показала соответствие видовому микробному составу, заявленному производителями в инструкциях у пробиотиков: Линекс Форте, Аципол Форте, Энтерол (табл. 1). У пробиотика Бак-Сет Форте при использовании различных питательных сред и различном времени культивирования было выделено только 2 вида бактерий из заявленных (табл. 1).

Число колониеобразующих единиц консорциума бактерий пробиотических штаммов соответствовало заявленным производителями в инструкциях для всех исследуемых пробиотиков (табл. 2).

Оценка культуральных возможностей пробиотиков (скорость роста/развития и степень биопленкообразования). Через 48 часов после начала культивирования при визуальной оценке отмечался рост всех пробиотиков (рис. 1). Наиболее активный рост и образование колоний отмечался у штаммов бактерий Аципол Форте (рис. 1В).

По результатам исследования способности образования биопленок микроорганизмами (OD среднее), входящими в состав исследуемых пробиотиков, установлено, что через день после начала культивирования все исследуемые пробиотики образуют биопленку (табл. 3).

Максимальная плотность биопленки у всех пробиотиков достигалась к 3-му дню. При этом Аципол Форте продемонстрировал наиболее выраженную способность к формированию биопленки в сравнении с другими пробиотиками с 1-го по 3-й день (рис. 2). Это свидетельствует о высокой активности микроорганизмов, входящих в состав данного пробиотика, и их эффективной способности образовывать сложные многоклеточные структуры. Есть основания предполагать, что активность бактерий Аципол Форте может быть связана с модулирующим действием цинка на штаммы бактерий пробиотика. Это согласуется с ранее опубликованными исследованиями, в которых описан механизм метаболического синергизма между цинком и пробиотическими штаммами [18].

Анализ показателей деградации биопленок на 6-е сутки культивирования выявил различия в стабильности сформировавшихся структур (табл. 3). Биопленки, образованные бактериальными штаммами, продемонстрировали большую устойчивость по сравнению с пробиотическим грибком, у которого дегидратация биопленки была максимальной и составила -34% (рис. 3). Биопленка, образованная микроорганизмами из состава Аципол Форте, демонстрировала меньшую степень деградации по сравнению с биопленками других пробиотиков, что указывает на более высокую устойчивость к деградации биопленочных структур при длительном культивировании. Это дает возможность ожидать высокого уровня колонизационной резистентности при клиническом применении.

Изучение антагонистических свойств исследуемых пробиотиков против модельных штаммов патогенных бактерий.
При изучении антагонистической активности исследуемых пробиотиков против планктонных клеток патогеных бактерий E. coli ATCC 25922 и C. difficile ATCC 43255 методом агаровых блоков при визуальной оценке наблюдалась антагонистическая активность по отношению к патогенам у всех бактериальных пробиотиков (Линекс Форте, Аципол Форте, Бак-Сет Форте). Однако у грибкового пробиотика (Энтерол) не проявились визуально наблюдаемые антагонистические свойства (рис. 4).

Оценка влияния микроорганизмов, входящих в состав пробиотиков, на формирующиеся биопленки модельного штамма E. coli.
Влияние пробиотиков на формирующиеся биопленки E. coli рассматривалось как модель острой инфекции при различных формах клинического течения инфекционного процесса, которая дает возможность предположить эффект от использования исследуемых пробиотиков in vivo при острых состояниях (острая кишечная инфекция, ААД и т. д.).
При оценке влияния пробиотиков на формирующиеся биопленки модельного штамма E. coli была выявлена при визуальном контроле высокая активность бактериальных пробиотиков (Аципол Форте, Линекс Форте, Бак-Сет Форте). Рост E. coli в лунках этих пробиотиков полностью отсутствовал (рис. 5). В высевах из лунок с грибковым пробиотиком Энтеролом наблюдался активный рост колоний E. coli, что было подтверждено их идентификацией методом времяпролетной масс-спектрометрии.

Биопленки, образованные бактериальными пробиотиками, были плотными и демонстрировали успешное подавление E. coli. Максимальную активность при формировании биопленки продемонстрировал Аципол Форте, оптическая плотность биопленки данного пробиотика превышала оптическую плотность других пробиотиков: на 55% — Бак-Сет Форте, на 95% — Линекс Форте, на 142% — Энтерол (рис. 6). Плотность биопленки, сформировавшейся в присутствии препарата Энтерол, оказалась сопоставима с плотностью контрольной биопленки E. coli.

Оценка способности пробиотиков воздействовать на зрелые биопленки E. coli ATCC 25922. Влияние пробиотиков на зрелые биопленки E. сoli рассматривалось как модель хронического течения инфекционного процесса, которая дает возможность предположить эффект от использования исследуемых пробиотиков in vivo при хронических состояниях, связанных с подавлением комменсальной микрофлоры и активации патогенов длительное время.

При оценке влияния пробиотиков на зрелые биопленки модельного штамма E. coli была выявлена при визуальном контроле высокая активность бактериальных пробиотиков (Аципол Форте, Линекс Форте, Бак-Сет Форте). Рост E. coli в лунках этих пробиотиков полностью отсутствовал (рис. 5).

Полученные данные свидетельствуют о способности бактериальных пробиотических штаммов активно формировать плотные структуры собственной микрофлоры поверх инактивированных биопленок патогенов. В высевах из лунок с грибковым пробиотиком Энтеролом наблюдался активный рост колоний E. coli, что было подтверждено их идентификацией методом времяпролетной масс-спектрометрии.

Максимальная плотность биопленки в присутствии сформированной биопленки E. coli также наблюдалась у пробиотика Аципол Форте, оптическая плотность биопленки которого превышала плотность биопленок других пробиотиков: на 41% Бак-Сет Форте, на 38% — Линекс Форте, на 90% — Энтерол (рис. 7). Плотность биопленки, сформировавшейся в присутствии препарата Энтерол, оказалась сопоставима с плотностью контрольной биопленки E. coli.

Показатели плотности биопленки нельзя напрямую связывать с пробиотической активностью. Но можно предположить, что продукция антагонистических факторов, выработка метаболитов, поддержание целостности стенок кишечника и иммунитета будут выше в биопленках большей плотности ввиду возможной большей концентрации клеток пробиотических штаммов. Также большая величина плотности биопленки дает возможность предположить, что биопленка будет образовывать усиленный барьер для патогенов на поверхности эпителия кишечника. Полученные в ходе экспериментов данные дают основание предположить, что исследуемые пробиотики инактивируют как формирующуюся, так и зрелую биопленку E. сoli. Используя биопленку патогена как первичный каркас, пробиотики формируют поверх свою биопленку, о чем свидетельствуют контрольные высевы, в которых отсутствует рост E. coli, а присутствует рост пробиотических микроорганизмов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В ходе исследования in vitro изучены культуральные возможности 4 популярных пробиотиков (скорость и плотность образования многовидовых биопленок), способность проявлять антагонистическую активность по отношению к патогенам E. сoli и C. difficile, изучено влияние пробиотиков как на формирование, так и на разрушение биопленок патогенных микроорганизмов.

На основании полученных результатов было выявлено, что все микроорганизмы, входящие в состав пробиотиков, образуют биопленки. Бактерии, входящие в состав Аципол Форте, за то же время культивирования, что и другие пробиотики, образует более плотную биопленку. Эта биопленка более устойчива относительно биопленок, образуемых сообществами микроорганизмов, входящих в состав других пробиотики, превосходит их по скорости роста и степени колонизации. Эти свойства могут позволить быстрее колонизировать поверхность кишечника и обеспечивать более стабильную защиту от кишечных патогенов.

При изучении антагонистических свойств различными методами было показано, что все бактериальные прибиотики проявляли антагонистическую активность как по отношению к планктонным клеткам E. coli и C. difficile, так и против формирующихся и сформированных биопленок E. coli. При этом наиболее выраженная активность наблюдалась у Аципол Форте.

При анализе активности против формирующейся и зрелой биопленки E. coli микроорганизмы, входящие в состав пробиотика Аципол Форте, показали наибольшее значение толщины биопленки относительно биопленок других пробиотиков. Эти показатели могут быть основой для предположения, что при заселении кишечника, пораженного биопленками патогенных бактерий, микроорганизмы, входящие в состав пробиотика Аципол Форте, будут активнее других пробиотиков инактивировать эти биопленки и поверх них образовывать пробиотические биопленки, создающие барьер для патогенов, а также уничтожать планктонные клетки патогенов в просвете кишечника.

Полученные данные дают возможность рассматривать использование современного пробиотика Аципол Форте, штаммовый состав которого усилен цинком, в качестве перспективного инструмента для быстрого решения различных клинических задач, связанных с дисбиозом.

Финансирование. Работа выполнена в рамках отраслевой программы НИР Роспотребнадзора.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Литература
1. Nelwan E.J., Herdiman A., Kalaij A.G.I., Lauditta R.K., Yusuf S.M., Suarthana E. Role of probiotic as adjuvant in treating various infections: a systematic review and meta-analysis. BMC Infect Dis. 2024;24(1):505.
2. Li X., Wang Q., Hu X., Liu W. Current Status of Probiotics as Supplements in the Prevention and Treatment of Infectious Diseases. Front Cell Infect Microbiol. 2022;12:789063.
3. Вялов С. С. Пробиотики при состояниях, сопровождающихся диареей. Доктор.Ру. Гастроэнтерология. 2016;1(118):47–53.
4. Захарова И.Н., Сугян Н.Г. Пробиотики для профилактики острых респираторных инфекций у детей: возможности применения. Медицинский Совет. 2021;(1):254–260.
5. Леонова М.В. Пробиотики в лечении заболеваний желудочно-кишечного тракта: эффективность с позиции доказательной медицины. Consilium Medicum. 2020;22(8):7–64.
6. Адгезия пробиотических микроорганизмов. [Электронный ресурс]. Режим доступа: https://propionix.ru/adgeziya-probioticheskikh-mikroorganizmov (дата обращения: 11.09.2025).
7. Слабоспицкая А.Т., Виноградов В.П., Крымовская С.С., Резник С.Р., Смирнов В.В. Новый препарат биоспорин и его влияние на микрофлору кишечника при дисбактериозах новорожденных детей. Микробиологический журнал. 1995;57(1):71–75.
8. Николаева С.В., Погорелова О.О., Шушакова Е.К., Горелов А.В. Иммуномодулирующие эффекты пробиотиков: возможности профилактики острых респираторных инфекций у детей. РМЖ. Мать и дитя. 2024;7(3):276–280.
9. Мазанкова Л.Н., Чеботарева Т.А., Майкова И.Д. Иммунологические эффекты комбинированных пробиотиков при вирусных диареях у детей. Эффективная фармакотерапия. Педиатрия. 2011;4:10–14.
10. Руженцова Т.А. Роль пробиотиков в формировании иммунитета. Лечащий врач. 2018;4:27–30.
11. Шевяков М.А., Бурыгина Е.В. Перспективные иммунонутриенты в общеврачебной практике. Терапевтический архив. 2014;6(2):96–101.
12. Пеньдюхова А.С., Белькова Н.Л., Охотина Ю.С., Иванчиков Е.А., Щекотова А.В., Семенова Н.В., Рычкова Л.В. Антагонистическая активность монокультур и консорциумов лактобацилл в отношении полирезистентных изолятов условно-патогенных бактерий как скрининг их пробиотического потенциала. Acta Biomedica Scientifica. 2024;9(3):121–129.
13. Павлов А.И., Хованов А.В., Фадина Ж.В. Борьба с эндогенной интоксикацией и восстановление кишечного барьера как цели назначения Энтеросгеля при диарее неинфекционного генеза. Эффективная фармакотерапия. Гастроэнтерология. 2019;1:54–62.
14. Пеньдюхова А.С., Белькова Н.Л., Савинова Ю.С., Воропаева Н.М., Смурова Н.Е., Клименко Е.С., Кондратов И.Г., Семенова Н.В., Рычкова Л.В. Пробиотические консорциумы: структура и антагонистическая активность в отношении условно-патогенных бактерий и нормобиоты человека (на примере Escherichia coli) in vitro. Acta Biomedica Scientifica. 2023;8(4):20–31.
15. Sun F., Qu F., Ling Y., Mao P., Xia P., Chen H., Zhou D. Biofilm-associated infections: antibiotic resistance and novel therapeutic strategies. Future Microbiol. 2013;8(7):877–886.
16. Ильина Т.С., Романова Ю.М. Бактериальные биопленки: роль в хронических инфекционных процессах и поиск средств борьбы с ними. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2021;39(2):14–24.
17. Stepanovic S., Vukovic D., Hola V., Di Bonaventura G., Djukic S., Cirkovic I., Ruzicka F. Quantification of Biofilm in Microtiter Plates: Overview of Testing Conditions and Practical Recommendations for Assessment of Biofilm Production by Staphylococci. APMIS. 2007;115(8):891–899.
18. Громова О.А., Торшин И.Ю., Сорокин А.И. Фармакоинформационное исследование синергизма воздействия на микробиоту кишечника пробиотиков Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103 (LGG), Bifi dobacterium longum CECT 7894 и цитрата цинка. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2025;(1):40–58. doi: 10.31146/1682-8658-ecg-233-1-40-58.

Сведения об авторах:

Детушева Елена Владимировна — к.б.н., научный сотрудник лаборатории антимикробных препаратов отдела молекулярной микробиологии ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора.

Сон Элизабет — младший научный сотрудник лаборатории антимикробных препаратов отдела молекулярной микробиологии ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора.

Детушев Константин Владимирович — научный сотрудник отдела коллекционных культур ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора.

Фурсова Надежда Константиновна — к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории антимикробных препаратов отдела молекулярной микробиологии ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора.

Кукес Илья Владимирович — к.м.н., руководитель научно-клинического отдела АНО «Международная ассоциация клинических фармакологов и фармацевтов», Москва, Россия; ORCID: 0000-0003-1449-8711.